Diowahi dening Peter Sarnow, Sekolah Kedokteran Universitas Stanford, Universitas Stanford, California, disetujoni tanggal 25 Desember 2020 (dideleng tanggal 25 Oktober 2020)
Kita nglaporake interaksi antarane subunit ing replikasi kompleks transkripsi coronaviruses, sing penting kanggo replikasi lan konservasi evolusi.Kita nyedhiyakake bukti yen domain NiRAN sing ana gandhengane karo nsp12 duwe aktivitas transferase nukleosida monofosfat (NMP) ing trans, lan nemtokake nsp9 (protein pengikat RNA) minangka target.NiRAN catalyzes lampiran kovalen saka NMP moiety menyang nsp9 terminal amino lestari ing reaksi sing gumantung ing ion Mn2+ lan ampas Asn lestari jejer.Ditemokake yen aktivitas NiRAN lan nsp9 NMPylation penting kanggo replikasi koronavirus.Data kasebut ngidini kita ngubungake aktivitas penanda enzim virus bersarang iki menyang pengamatan sadurunge ing hipotesis yen wiwitan sintesis RNA ing kelas virus RNA sacara fungsional lan evolusioner konsisten.
RNA polimerase (RdRps) sing gumantung karo RNA saka Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, lan 12 kulawarga liyane) disambungake menyang domain terminal amino (N-terminal) ing protein non-struktural (nsp) sing dibebasake saka poliprotein, sing diarani NiRAN. 1ab dumadi saka protease utama virus (Mpro).Sadurunge, virus arteri NiRAN-RdRp nsp aktivitas GMPylation / UMPylation dhewe wis kacarita, lan disaranake kanggo ngasilake transien kanggo transfer nukleosida monofosfat (NMP) menyang virus (saiki ora dingerteni) lan / utawa biopolimerisasi sel Things.Ing kene, kita nuduhake manawa koronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E lan Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) nduweni aktivitas NMPylation sing gumantung Mn2+, sing asale saka nsp9 liwat pambentukan nsp9 sing dimediasi Mpro Sawise. N-terminal flanking nsps dirilis proteolytically, phosphoramidate kaiket ing amina utami (N3825) ing N-terminal nsp9.Uridine trifosfat minangka nukleotida sing disenengi ing reaksi iki, nanging adenosin trifosfat, guanosin trifosfat, lan sitidin trifosfat uga cocok kanggo substrat.Pasinaon mutasi nggunakake protein nsp9 lan nsp12 coronavirus rekombinan lan mutan HCoV-229E sing direkayasa sacara genetis nemtokake residu sing dibutuhake kanggo nsp9 NMPylation lan replikasi virus sing dimediasi NiRAN ing kultur sel.Data kasebut dikonfirmasi prediksi residu situs aktif NiRAN lan nemtokake peran penting residu nsp9 N3826 ing nsp9 NMPylation lan replikasi virus in vitro.Residu iki minangka bagéan saka urutan tripeptida N-terminal NNE sing dikonservasi lan kabukten minangka siji-sijine residu invarian saka nsp9 lan homolog ing kulawarga koronavirus.Panaliten iki nyedhiyakake dhasar sing kuat kanggo sinau fungsional aktivitas NMPylation saka virus bersarang liyane lan ngusulake target sing bisa ditindakake kanggo pangembangan obat antivirus.
Virus RNA untaian positif Nidovirales nginfèksi macem-macem vertebrata lan invertebrata (1, 2).Urutan saiki kalebu 14 kulawarga (3), sing kulawarga Coronavirus wis ditliti sacara ekstensif sajrone 20 taun kepungkur.Ing wektu kasebut, telung coronavirus zoonotik muncul saka host kewan lan nyebabake wabah infeksi pernapasan sing abot ing manungsa.Kalebu pandemi sing terus-terusan sing disebabake dening penyakit infèksius akut sing abot.Sindrom Pernafasan Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirus duwe organisasi genom sing umum, lan subunit saka kompleks transkripsi-replikasi-membran (RTC) dienkode ing rong pertiga terminal 5-?² lan subunit struktural utama partikel virus, uga sawetara aksesoris. .Protein, dienkode ing 3??² pungkasan katelu saka génom (1).Kajaba siji kulawarga virus planarian (Monoviridae) (8), kabeh virus nested encode subunit RTC ing rong pigura mbukak gedhe (ORF) ORF1a lan ORF1b, kang diterjemahake saka RNA genom saka.ORF1a ngode poliprotein (pp) 1a, lan ORF1a lan ORF1b bebarengan encode pp1ab.Kanthi partisipasi umum saka protease utama (Mpro) sing dikode dening ORF1a, pp1a lan pp1ab diproses kanthi proteolitik dadi macem-macem protein non-struktural (nsps), uga dikenal minangka 3CLpro, amarga nduweni homologi karo 3Cpro saka picornavirus ( 9).nsps iki dianggep bakal nglumpuk dadi RTC dinamis gedhe, catalyze sintesis RNA genom (replikasi) lan pesawat saka RNA subgenomic (transkripsi), lan digunakake kanggo koordinasi ekspresi ORF dumunung ing hilir ORF1b (10? ? ?12).
Inti RTC kalebu RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helikase (HEL1) (14, 15) lan sawetara enzim pangolahan RNA, sing utamané dienkode ing ORF1b lan ing kulawarga koronavirus Isine nsp12-nsp16 lan nsp9-nsp12 ing kulawarga Arterioviridae (ndeleng referensi 10ââ 12).RdRp lan HEL1 makili rong (seperlima) domain sing dikonservasi saka virus sarang manuk lan duwe homologi ing antarane virus RNA liyane.Replika inti dipercaya dibantu dening subunit liyane, kalebu sawetara nsps cilik sing dibebasake saka wilayah carboxy-terminal (terminal C) pp1a, hilir Mpro (coronavirus nsp5 lan virus arteri nsp4, masing-masing).Dheweke duwe proteksi khusus kulawarga lan macem-macem kegiatan sing winates (dideleng ing referensi 10ââ12).
Relatif bubar, domain kanthi ciri motif urutan unik ditemokake ing terminal amino (N-terminus) sing cedhak karo RdRp ing kabeh virus bersarang, nanging ora ana virus RNA liyane (16).Adhedhasar lokasi lan aktivitas transferase nukleotida (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), domain iki dijenengi NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Kombinasi dual-domain NiRAN-RdRp minangka nsp12 ing kulawarga Coronaviridae lan nsp9 ing kulawarga Arterioviridae, lan ing nestoviridae liyane, NiRAN-RdRp samesthine bakal dirilis minangka nsp independen saka poliprotein virus.Ing coronavirus, domain NiRAN ngemot residu 1/450 lan disambungake menyang domain C-terminal RdRp liwat wilayah linker (16?19).Ing Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombinan nsp9 nuduhake Mn2 + ion-dependent (self) UMPylation lan aktivitas GMPylation, sing gumantung ing telung basis urutan sing dikonservasi ing nestovirus, AN, BN lan CN The residues ing urutan kasebut.Endi N tegese NiRAN) (16).Simpingan N-terminal saka motif kasebut minangka motif preAN sing kurang konservatif.Sawetara ampas iki uga disimpen ing kinase protein sing ana hubungane adoh, ing ngendi padha wis ditampilake melu ing nucleoside triphosphate (NTP) naleni lan aktivitas katalitik (20, 21).Selaras karo pengamatan iki, sawetara residu situs aktif utama ing pseudokinase SelO saka Pseudomonas syringae bisa dirakit karo superkompleks SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 sing bubar diterbitake.Residu NiRAN Coronavirus sing disimpen ditumpangake ing struktur mikro elektron.Protein rekombinan (17).Spekulasi manawa U / GMPylation sing didokumentasikake bakal ngasilake negara sementara kanggo nransfer NMP menyang substrat (saiki ora dingerteni) (16), lan persamaan struktural antarane NiRAN lan protein kinase (17, 19) ) Iku hipotesis sing NiRAN ngowahi protein liyane.
Akeh fitur, kalebu asosiasi sistematis sing unik lan unik karo virus bersarang lan pamisahan genetis saka RdRp, ndadekake NiRAN minangka enzim pangaturan kunci sing cukup kanggo virus bersarang, sing penting kanggo muncule lan identitase.Sadurunge, telung fungsi sing bisa nglibatake NiRAN kanggo ngatur terjemahan genom/subgenomik utawa replikasi/transkripsi diarani.Nalika nimbang data langka lan ora lengkap kasedhiya ing wektu, saben fungsi duwe kaluwihan lan cacat (16).Ing panliten iki, tujuane kanggo nggabungake studi genetik biokimia lan mbalikke saka koronavirus sing makili rong genera kasebut, lan nempatake temuan kita ing latar mburi evolusi mutasi alami kulawarga koronavirus, supaya bisa ngerteni babagan alam Misterius iki.Kita nglaporake kemajuan gedhe babagan pemahaman NiRAN liwat identifikasi target alami ing RTC, sing (ing antarane telung hipotesis sing kasedhiya) nyumbang kanggo peran domain iki kanggo miwiti sintesis RNA virus bersarang.Panaliten iki uga mbukak kemungkinan peran NiRAN liyane ing antarmuka host virus.
Kanggo menehi ciri sifat enzimatik saka domain NiRAN sing gegandhengan karo virus korona nsp12, kita ngasilake wangun rekombinan saka coronavirus manungsa 229E (HCoV-229E) nsp12 ing E. coli, kanthi tag His6 ing terminal C, lan nggabungake protein karo [α32-P ] Inkubasi bebarengan karo NTP ing ngarsane MnCl2 minangka diterangake ing Bahan lan Metode.Analisis produk reaksi kasebut nuduhake anané protein radiolabeled sing migrasi bebarengan karo nsp12 (106 kDa), nuduhake manawa coronavirus nsp12 mengkatalisasi pambentukan tambahan protein-NMP kovalen, sing luwih disenengi dibentuk karo uridine monofosfat (UMP) (Gambar 1A) Lan B).Analisis kuantitatif nuduhake yen dibandhingake karo nukleotida liyane, intensitas sinyal penggabungan UMP mundhak 2 nganti 3 kali (Gambar 1C).Data iki konsisten karo aktivitas transferase NMP sing diprediksi saka domain NiRAN saka coronavirus (16), nanging nuduhake yen preferensi nukleotida saka domain NiRAN saka coronavirus lan virus arteri beda.
Aktivitas Self-NMPylation saka HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) diinkubasi nganggo NTP [α-32P] sing ditemtokake ing ngarsane 6 mM MnCl2 suwene 30 menit (pirsani Bahan lan Metode kanggo rincian).Produk reaksi dipisahake dening SDS-PAGE lan diwarnai karo Coomassie biru sarwa.(B) Protein radiolabeled digambarake kanthi pencitraan fosfor.Posisi nsp12-His6 lan penanda massa molekul protein (ing kilodaltons) ditampilake ing A lan B. (C) Intensitas sinyal radioaktif (rata-rata ± SEM) ditemtokake saka telung eksperimen independen.*P≤0.05.Kekuwatan sinyal (persentase) ana hubungane karo UTP.
Sanajan aktivitas enzim sing gegandhengan karo NiRAN wis dituduhake penting kanggo replikasi EAV lan SARS-CoV ing kultur sel (16), fungsi NiRAN tartamtu lan target potensial durung ditemtokake.Persamaan struktural sing anyar dilapurake antarane NiRAN lan kulawarga protein kanthi lipatan kaya protein kinase (17, 22) nyebabake kita nyoba hipotesis yen NiRAN mengkatalisasi NMPylation saka protein liyane.Kita ngasilake set target homolog potensial, kalebu protein non-struktural sing dikode dening HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), saben ngemot tag His6 terminal C (lampiran SI, Tabel S1), Lan inkubasi protein iki karo [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) ing ngarsane utawa ora ana nsp12.Albumin serum sapi lan protein fusi MBP-LacZα sing diprodhuksi ing E. coli dadi kontrol (Gambar 2A, jalur 1 nganti 7).Protein radiolabeled dianalisis kanthi elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) lan autoradiografi, lan ditemokake yen ana sinyal radioaktif sing kuwat ing reaksi sing ngemot nsp12 lan nsp9.Posisi sinyal cocog karo massa molekul nsp9, nuduhake nsp12-mediated UMPylation saka nsp9 (Gambar 2B, trek 7).Ora ana protein tes liyane sing ditemokake minangka UMPylated, sing ndadekake kita nyimpulake yen nsp9 minangka substrat spesifik nsp12.Konsisten karo data self-NMPylation sing ditampilake ing Gambar 1, nsp12 bisa nransfer kabeh papat NMP menyang nsp9, sanajan efisiensi beda, UMP> adenosine monofosfat (AMP)> guanosine monofosfat (GMP)> cytidine monofosfat (CMP) ) ( Gambar).3 A lan B).Ing kahanan sing digunakake ing tes iki (nyepetake reaksi lan wektu cahya, nyuda konsentrasi nsp12; bahan lan metode), NMPylation dhewe saka nsp12 ora bisa dideteksi (bandhingake Gambar 2B, jalur 7, lan Gambar 1B), sing mbuktekaken efektif (Lan kaping babak) UMP dipindhah saka nsp12 kanggo nsp9.Aktivitas transferase UMP mbutuhake anané ion Mn2+, kaya sing dituduhake ing Gambar 3C, nalika mung aktivitas transferase UMP minimal sing diamati ing ngarsane Mg2+, lan ora ana aktivitas ing ngarsane rong kation divalen liyane sing diuji.Data sing padha ditampa ing tes NMPylation sing ngemot cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), lan adenosine triphosphate (ATP) (SI lampiran, Gambar S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation saka nsp9.Serangkaian substrat protein (kalebu albumin serum sapi, MBP-lacZα, lan seri HCoV-229E nsps sing dilabel karo C-terminal His6 sing dikode dening ORF1a) digunakake kanggo ngevaluasi aktivitas UMPylation saka HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated protein.Inkubasi protein nganggo [α-32P] UTP suwene 10 menit tanpa ana (A) utawa ana (B) nsp12 kaya sing diterangake ing bahan lan metode.Ing sisih ndhuwur A lan B, gel SDS-polyacrylamide sing diwarnai karo Coomassie Brilliant Blue ditampilake, lan ing sisih ngisor A lan B, autoradiograms sing cocog ditampilake.Posisi penanda massa molekul protein (ing kilodaltons) diwenehi ing sisih kiwa.Posisi nsp12-His6 (B, ndhuwur) lan sinyal radioaktif sing diamati sajrone inkubasi nsp12-His6 karo nsp9-His6 (B, lane 7) uga dituduhake, sing nuduhake yen [α-32P]UMP nganti nsp9-His6 (12,9 kDa), sing ora diamati kanggo protein liyane sing diuji.
HCoV-229E NiRAN-mediated biokimia lan karakterisasi virologi nsp9 NMPylation.(A lan B) Peran ko-substrat nukleotida sing digunakake ing reaksi kasebut.Nsp12-His6 lan nsp9-His6 dicampur lan diinkubasi ing ngarsane NTP [α-32P] sing beda ing tes NMPylation standar.(A, ndhuwur) Coomassie-stained nsp9-His6 dipisahake dening SDS-PAGE.(A, ngisor) Autoradiograph saka area gel sing padha.(B) Aktivitas relatif (rata-rata ± SEM) ing ngarsane kofaktor nukleotida sing ditemtokake ditemtokake saka telung eksperimen independen.*P≤0.05.(C) Peran ion logam.Dituduhake minangka tes NMPylation standar ing ngarsane [α-32P] UTP lan ion logam sing beda, saben konsentrasi 1 mM.Ing C, ndhuwur, Coomassie stained nsp9-His6 ditampilake, lan ing C, ngisor, autoradiography sing cocog ditampilake.Ukuran protein sing dilabeli (ing kilodalton) dituduhake ing sisih kiwa A lan C. (D) Bentuk mutan HCoV-229E nsp12-His6 mawa substitusi asam amino sing ditemtokake ana ing [α-32P]UTP, kaya sing diterangake. ing Bahan lan Metode.Nsp9-His6 radiolabeled sing diprodhuksi ing reaksi NMPylation dideteksi dening pencitraan fosforilasi (D, ndhuwur).Aktivitas relatif dibandhingake karo jinis alam bébas (wt) protein ditampilake ing D, lan ngisor dijupuk minangka rata-rata (± SEM) saka telung eksperimen Independent.Tanda bintang nuduhake substitusi saka residu non-konservasi.(E) Titer virus ing supernatan kultur sel p1 dipikolehi 24 jam sawise infèksi ditemtokake dening assay plak.Substitusi kodon ing domain NiRAN saka mutan HCoV-229E sing direkayasa dituduhake (panomeran residu adhedhasar posisi ing pp1ab).Mutant situs aktif RdRp sing kurang replikasi nsp12_DD4823/4AA digunakake minangka kontrol.
Kanggo ngerteni luwih jero babagan situs aktif NiRAN lan nemtokake residu sing ana gandhengane karo aktivitas transferase NMP spesifik nsp9, kita nindakake analisis mutasi, ing ngendi kita ngganti residu konservatif ing motif NiRAN AN, BN lan CN ( 16) Ala (lampiran SI, Gambar S2).Kajaba iku, pengaruh substitusi Arg-to-Lys utawa Lys-to-Arg konservatif dievaluasi ing rong kasus.Minangka kontrol (negatif), residu sing ora utawa kurang disimpen ing domain NiRAN koronavirus lan virus bersarang liyane diganti karo Ala. Ngganti K4116A (ing motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif). BN) lan D4280A (CN) kanthi signifikan nyuda utawa malah ngilangi nsp9 NMPylation liwat nsp12, dene protein kanthi substitusi konservatif (R4178K), K4116R) nahan 60% lan 80% aktivitase, sing nuduhake yen relaksasi watesan ing sisih dhewe. chain sensitif fisikokimia (Gambar 3D).Ngganti sawetara residu konservasi liyane E4145A, D4273A, F4281A lan D4283A kurang mbebayani, lan nsp9 UMPylation mung suda.Asil sing padha dipikolehi ing reaksi nsp9 NMPylation sing nglibatake NTP liyane (Gambar 3D lan lampiran SI, Gambar S3), nandheske yen efek sing diamati ing substitusi asam amino spesifik ora gumantung saka jinis ko-substrat nukleotida sing digunakake.Sabanjure, kita nyoba pengaruh sing bisa ditindakake saka substitusi nsp12 kasebut ing replikasi koronavirus ing kultur sel.Kanggo tujuan iki, kita nggunakake cithakan DNA komplementer (cDNA) rekayasa genetik sing cocog sing dikloning ing virus vaksinasi rekombinan (23, 24) kanggo transkripsi 5 -7 sel.Titrasi progeni virus infèksius sing diprodhuksi ing sel kasebut nuduhake manawa sebagian besar mutan HCoV-229E NiRAN ora bisa ditindakake (Gambar 3E).Klompok mutan virus sing ora bisa urip kalebu alternatif sing wis ditampilake kanggo ngilangi utawa nyuda aktivitas transferase sacara signifikan ing vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), nanging ana rong alternatif liyane (K4116R, E4145A) 80 % dilindhungi undhang-undhang?Aktivitas NMPylation in vitro nuduhake manawa ana watesan tambahan.Kajaba iku, rong mutasi liyane (R4178K, F4281A) sing nyebabake nyuda moderat ing aktivitas NMPylation in vitro NiRAN ngasilake virus urip, nanging virus kasebut nyuda titer kanthi signifikan liwat replikasi.Konsisten karo data aktivitas in vitro sing ditampilake ing Gambar 3D, ngganti papat residu liyane sing ora disimpen ing coronavirus lan/utawa virus bersarang liyane (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ngasilake virus sing sregep. titer sing rada suda dibandhingake karo virus jinis liar (Gambar 3E).
Kanggo nyinaoni apa aktivitas transferase NMP sing dimediasi NiRAN gumantung saka domain RdRp sing aktif, loro residu Asp sing dikonservasi sing melu koordinasi ion logam divalen (11) ing RdRp motif C diganti Ala. Protein sing diasilake nsp12_DD4823/4AA nahan. aktivitas NMPylation nsp9 sawijining, nuduhake yen nsp12-mediated in vitro nsp9 aktivitas NMPylation ora mbutuhake aktivitas polimerase (SI Lampiran, Gambar S4).
Sawise netepake aktivitas transferase NMP-nsp9 khusus kanggo nsp12, kita nyoba menehi ciri tambahan NMP-nsp9 kanthi spektrometri massa (MS).Spektrum massa protein lengkap HCoV-229E nsp9 rekombinan nuduhake puncak ing 12.045 Da (Gambar 4A).Penambahan nsp12 ora ngowahi kualitas nsp9, sing nuduhake nsp12 lan nsp9 ora bakal mbentuk kompleks sing stabil ing kondisi sing digunakake (denaturasi) (Gambar 4A).Ing ngarsane UTP lan GTP, pangukuran massa reaksi sing ngemot nsp9 lan nsp12 masing-masing nuduhake yen massa protein UTP pindhah 306 Da, lan massa protein GTP pindhah 345 Da, nuduhake yen saben molekul nsp9 ngiket UMP utawa GMP. (Gambar 4) C lan D).Dikira-kira yen energi sing dibutuhake kanggo nsp9 NMPylation sing dimediasi NiRAN asale saka hidrolisis NTP lan rilis pirofosfat.Senajan keluwihan molar 10 kali lipat saka nsp9 (target) tinimbang nsp12 (enzim) digunakake ing reaksi iki, NMPylation meh lengkap nsp9 diamati, nuduhake yen interaksi antarane nsp12 lan nsp9 cendhak, lan nsp12 bisa NMPylate luwih nsp9. molekul in vitro.
NMPylation tunggal nsp9 ing ngarsane nsp12 lan UTP utawa GTP.Dituduhake yaiku spektrum massa protein lengkap deconvoluted HCoV-229E nsp9 (lampiran SI, Tabel S1) (AD).(A) nsp9 piyambak, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 ing ngarsane UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ing ngarsane GTP.
Kanggo nemtokake residu nsp9 UMPylated dening nsp12, nsp9-UMP dibelah karo trypsin.Peptida sing diasilake dipisahake dening kromatografi cair kinerja tinggi nano (HPLC) lan dianalisis kanthi spektrometri massa tandem (MS / MS) online.Analisis data nggunakake paket piranti lunak Byonic (Metrik Protein) nuduhake UMPilasi asam amino terminal N.Iki dikonfirmasi kanthi manual.Spektrum massa tandem saka peptida prekursor [UMP] NNEIMPGK (lampiran SI, Gambar S5A) nuduhake pecahan ing 421 m / z, nuduhake yen UMP ngiket residu 1 saka nsp9.
Ing N-terminus nsp9, Asn dikonservasi ing antarane anggota Orthocoronavirinae (lampiran SI, Gambar S6).Senajan kita pracaya yen nitrogen amina utami N-terminal punika akseptor paling kamungkinan kanggo UMP, kita mutusaké kanggo njupuk bukti tambahan NMP naleni ing N-terminal.Mulane, non-NMPylated lan NMPylated N-terminal peptida nsp9 diresiki dening HPLC iki asalé ing ngarsane aseton lan sodium cyanoborohydride.Ing kahanan kasebut, mung amina primer gratis sing bisa diowahi nganggo propil (25).Peptida asale saka N-terminal nsp9 kanthi urutan NNEIMPGK ngemot rong amina utama, siji ing N-terminus Asn lan liyane ing rantai sisih Lys ing C-terminus.Mulane, gugus propil bisa dienal ing loro ujung.Kromatogram ion sing diekstrak saka peptida non-NMPylated ditampilake ing apendiks SI, Gambar S5B.Kaya sing dikarepake, N-terminal lan C-terminal (mono) propylated (lampiran SI, Gambar S5B, jalur ndhuwur) lan peptida dipropylated (lampiran SI, Gambar S5B, jalur ngisor) bisa diidentifikasi.Pola iki owah kanthi nggunakake peptida N-terminal NMPylated saka nsp9.Ing kasus iki, mung peptida propil C-terminal sing bisa diidentifikasi, nanging peptida propil N-terminal lan peptida dipropylated ora diidentifikasi (Lampiran SI, Gambar S5C), nuduhake yen UMP wis ditransfer menyang amina primer N-terminal Kanggo nyegah iki. klompok saka nggawe owah-owahan.
Sabanjure, kita ngganti (karo Ala utawa Ser) utawa mbusak residu konservasi ing N-terminus nsp9 kanggo nemtokake watesan target-tartamtu.Adhedhasar data MS kita sing nuduhake yen NiRAN mbentuk adduct nsp9-NMP karo amina utama residu N-terminal saka nsp9, kita hipotesis yen nsp9 NMPylation mbutuhake protease master virus (Mpro, nsp5) kanggo ngeculake nsp9 N-terminal saka prekursor poliprotein kasebut.Kanggo nguji hipotesis iki, kita ngasilake protein prekursor nsp7-11 sing ngemot nsp9 ing E. coli lan nindakake tes NMPylation standar ing ngarsane [α-32P] UTP (bahan lan metode).Kaya sing dituduhake ing Gambar 5A (jalur 3), prekursor nsp7-11 sing ora dipotong ora dilabeli karo nsp12.Ing kontras, yen nsp7-11 dipecah dening rekombinan nsp5 kanggo ngeculake nsp9 (lan nsps liyane) saka prekursor, protein radiolabeled sing migrasi karo nsp9 dideteksi, konfirmasi kesimpulan kita yen NiRAN lan N- Selektif pembentukan kovalen nsp9-NMP adducts. .Amina utami terminal saka Asn-terminal N (posisi 3825 ing pp1a/pp1ab).Kesimpulan iki uga didhukung dening eksperimen nggunakake konstruksi nsp9, sing ngemot siji utawa loro residu tambahan ing N-terminus.Ing kasus loro, UMPylation NSP9 sing dimediasi NiRAN dibuwang (Lampiran SI, Gambar S7).Sabanjure, kita ngasilake protein kanthi siji utawa loro residu Asn sing dibusak saka urutan peptida 3825-NNEIMPK-3832 ing N-terminal nsp9.Ing kasus loro, nsp9 UMPylation rampung diblokir (Gambar 5B), nyedhiyakake bukti tambahan yen nsp9 N-terminus nyata tumindak minangka reseptor NMP.
Pangolahan proteolitik saka nsp9 lan peran residu N-terminal ing UMPylation-mediated nsp12.(A) nsp9 UMPylation mbutuhake nsp9 N-terminal gratis.Nsp7-11-His6 wis diinkubasi ing 30 ° C ing buffer deteksi NMPylation sing ngemot UTP ing ngarsane utawa ora ana rekombinan Mpro (nsp5-His6).Sawise 3 jam, miwiti tes NMPylation kanthi nambah nsp12-His6 kaya sing diterangake ing Bahan lan Metode.Reaksi sing ngemot nsp5-His6 (jalur 1) lan nsp9-His6 (jalur 2) digunakake minangka kontrol.Sawise 10 menit, reaksi diakhiri lan campuran reaksi dipisahake dening SDS-PAGE.Protein kasebut diwarnai karo Coomassie Brilliant Blue (A, ndhuwur).Prekursor Nsp7-11-His6 lan produk sing diproses asil saka cleavage mediated nsp5-His6 ditampilake ing sisih tengen.Wigati dicathet (amarga ukurane cilik) nsp7 lan nsp11-His6 ora bisa dideteksi ing gel iki, lan reaksi kasebut ditambah karo nsp5-His6 (jalur 1 lan 4; posisi nsp5-His6 dituduhake kanthi bunder padhet) utawa nsp9-His6 (Lane 2) ngemot jumlah cilik saka MBP (dituduhake dening bunderan mbukak) minangka impurities ampas amarga padha ditulis minangka protein fusi MBP (SI lampiran, Tabel S1).(B) Varian Nsp9-His6 ora duwe siji utawa loro residu Asn terminal N (nomer residu miturut posisi ing pp1a / pp1ab) lan diresiki lan diinkubasi karo nsp12-His6 lan [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE diwarnai karo Coomassie ditampilake ing sisih ndhuwur, B, autoradiograph sing cocog ditampilake ing sisih ngisor.Posisi penanda bobot molekul (ing kilodalton) ditampilake ing sisih kiwa.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal residu konservasi diganti karo Ala utawa Ser, lan jumlah protein sing padha digunakake ing reaksi UMPylation mediated nsp12-His6.Produk reaksi dipisahake dening SDS-PAGE lan diwarnai karo Coomassie Brilliant Blue (C, ndhuwur), lan radiolabeled nsp9-His6 dideteksi dening pencitraan phosphorescence (C, tengah).Nggunakake protein jinis liar (wt) minangka referensi (diset menyang 100%), aktivitas NMPylation relatif (rata-rata ± SEM) diitung saka telung eksperimen independen.(D) Titer virus ing supernatan kultur sel p1 saka sel Huh-7 sing kena infeksi sel Huh-7 jinis liar HCoV-229E, lan mutan sing nggawa substitusi asam amino sing ditunjuk ing nsp9 ditemtokake kanthi uji plak.Motif RdRp sing kurang replikasi C mutan ganda DD4823/4AA digunakake minangka kontrol negatif.
N-terminus nsp9 (utamane posisi 1, 2, 3, lan 6) banget lestari ing antarane anggota subfamili Orthocoronavirinae (lampiran SI, Gambar S6).Kanggo nyinaoni kemungkinan peran residu kasebut ing nsp12-mediated nsp9 NMPylation, loro residu Asn berturut-turut ing N-terminus nsp9 diganti karo Ala utawa Ser (piyambak utawa kombinasi).Dibandhingake karo nsp9 jinis alam bébas, ngganti N3825 karo Ala utawa Ser ngasilake luwih saka kaping pindho abang ing nsp12-mediated UMPylation (Gambar 5C).Konsisten karo kesimpulan kita yen NMPylation dumadi ing amina primer N-terminal tinimbang rantai sisih residu N-terminal, kita mirsani NMPylation residual sing signifikan kanthi ngganti N3825A lan N3825S.Apike, yen Asn kapindho diganti dening Ala utawa Ser, nsp9 UMPylation suda luwih kuwat (luwih saka 10 kaping), nalika ngganti Ala ing posisi 3, 4, lan 6 mung duwe efek moderat ing nsp9 UMPylation (Gambar 2). ).5C).Asil sing padha dijupuk nggunakake ATP, CTP utawa GTP (SI lampiran, Gambar S8).Secara kolektif, data kasebut nuduhake peran kunci N2826 (posisi 2 ing nsp9) ing nsp9 NMPylation.
Kanggo entuk bukti tambahan babagan korélasi fungsional antarane N-terminus nsp9 lan NMPylation, kita nindakake multisequence alignment (MSA) saka urutan nsp9 saka kulawarga Coronavirus (variasi antarane 104 lan 113 residu) (SI Lampiran, Gambar. S6).Secara total, ing 47 spesies (dikenal lan diduga) saka 5 genera saka subfamili Orthocoronavirinae sing nginfèksi mamalia, manuk, lan inang reptil sing béda-béda, mung total 8 residu sing ditemokake minangka invarian.Owah-owahan sing paling akeh, kalebu pambusakan lan sisipan, diamati ing siklus antarane unsur struktur sekunder nsp9, kaya sing ditemtokake dening studi struktural sadurunge (26 ??28).Lima residu invarian ditemokake ing untaian β lan heliks α saka bagean terminal-C saka nsp9.Telung residu invarian minangka motif NNE saka ujung N saka nsp9.Dicethakaké manawa Asn kaloro saka motif iki minangka siji-sijine sisa invarian, sing uga dituduhake dening nsp9 hipotetis saka coronavirus kodhok sing ana hubungane, lan makili spesies Microhyla letovirus 1 ing subfamili Letovirinae saka Alphaletovirus.Konservasi residu ing unsur struktur sekunder nsp9 bisa dirasionalake kanthi pertimbangan struktural kanggo njaga sifat-sifat ikatan RNA lempitan utawa dikenal.Nanging, pertimbangan iki ora ditrapake kanggo konservasi NNE, lan sadurunge panliten iki, sifat kendala sing mbatesi variasi urutan tripeptida wis rampung ora jelas.
Kanggo nemtokake pentinge nsp9-NMPylation lan konservasi NNE ing replikasi koronavirus, kita ngasilake mutan HCoV-229E, sing nggawa substitusi siji utawa kaping pindho residu nsp9 N-terminal, sing nuduhake nsp9 NMPylation mbebayani ing vitro.Sadurunge kita miwiti, kita nyoba kanggo njawab pitakonan apa substitusi iki (cedhak nsp8 | 9 situs cleavage) mengaruhi Processing proteolytic wilayah C-terminal pp1a.Sakumpulan konstruksi poliprotein nsp7-11 sing ngemot substitusi sing cocog ing N-terminus nsp9 diprodhuksi ing E. coli lan dipotong nganggo rekombinan Mpro.Pembelahan proteolitik saka papat situs kasebut (kalebu situs flanking nsp9) ora kena pengaruh kanthi signifikan dening substitusi sing dienalake (lampiran SI, Gambar S9), ora kalebu owah-owahan struktural ing protein kasebut sing ngganggu pembelahan nsp8|9 sing dimediasi Mpro (Utawa liyane) situs web.
Sèl Huh-7 ditransfeksi nganggo RNA HCoV-229E sing dawa genom, ngodhe substitusi Ala utawa Ser ing tripeptida NNE sing dikonservasi (N3825, N3826, lan E3827) ing terminal nsp9 N, nuduhake manawa mutasi kasebut nyebabake fatal.Kita bisa nylametake virus kasebut kanthi ngganti Ser utawa Ala saka N-terminal Asn (N2835A utawa N2835S), nanging gagal mbalekake virus kasebut kanthi mutasi siji lan ganda liyane ing urutan NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Gambar 5D).
Asil kasebut nuduhake manawa replikasi koronavirus ing kultur jaringan diwatesi (padha utawa padha), mbatesi mutasi alami situs NMPylation nsp9 ing awak, lan ndhukung peran kunci respon kasebut ing siklus urip koronavirus.
Ing set eksperimen pungkasan, kita ngasilake C-terminal His6 kanthi label SARS-CoV-2 nsp12 lan nsp9, lan rong bentuk mutan nsp12 ing E. coli.Sisa situs aktif ing domain NiRAN lan RdRp mungguh Gunakake Ala tinimbang (Gambar 6A lan lampiran SI, Tabel S2).K4465 ing SARS-CoV-2 nsp12 cocog karo K4135 ing HCoV-229E (Lampiran SI, Gambar S2), sing kabukten dibutuhake kanggo aktivitas NiRAN lan replikasi HCoV-229E (Gambar 3D lan E).Residu iki uga cocog karo residu virus arteri EAV nsp9 K94, sing sadurunge dituduhake perlu kanggo NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation (16).Kaya sing ditampilake ing Gambar 6B, SARS-CoV-2 nsp12 nduweni aktivitas transferase UMP nggunakake nsp9 minangka substrat, dene mutan situs aktif nsp12_K4465A ora aktif.Substitusi ganda ing urutan karakteristik SDD saka RdRp motif C ora mengaruhi aktivitas transferase UMP (Gambar 6B), nuduhake yen aktivitas RdRp ora duwe pengaruh langsung ing nsp9 UMPylation.Data sing padha dijupuk nggunakake CTP, GTP lan ATP (lampiran SI, Gambar S10).Ringkesan, data kasebut nuduhake nsp9 NMPylation sing dimediasi NiRAN duwe kegiatan konservatif ing coronavirus sing makili macem-macem genera saka subfamili orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation of nsp9.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel nuduhake protein rekombinan digunakake ing test NMPylation.Minangka kontrol, protein mutan kanthi substitusi situs aktif ing domain NiRAN (K4465A) lan domain RdRp (DD5152/3AA) saka SARS-CoV-2 nsp12 digunakake.Penomeran residu adhedhasar posisi ing pp1ab.(B) Autoradiograph deteksi UMPylation nggunakake nsp9-His6 lan [α-32P]UTP minangka substrate nsp12-His6 (jinis liar [wt] lan mutan).Massa molekul (ing kilodalton) saka protein sing diwenehi label ditampilake ing sisih kiwa.
Domain NiRAN umume dilestarekake ing Nidovirales (16), sing nuduhake yen dheweke nggawe katalis reaksi enzimatik sing penting kanggo replikasi Nidovirus.Ing panliten iki, kita bisa mbuktekake manawa domain NiRAN saka coronavirus nransfer NMP (digawe saka NTP) menyang nsp9, protein pengikat RNA misterius sing melu replikasi virus (26 ?? 29), kanggo nemtokake minangka target alami lan mitra saka coronavirus RTC.
Domain NiRAN nuduhake telung motif urutan (AN, BN, lan CN), sing ngemot jumlah residu sing sithik banget sing disimpen ing kabeh kulawarga ing urutan Nidovirales monofiletik nanging beda banget (8, 16).Panaliten anyar nuduhake manawa struktur kasebut ana hubungane karo kulawarga protein kaya protein kinase sing umume ora dingerteni, sing asline diarani kulawarga SelO (17, 19, 22, 30, 31).Protein sing ana hubungane karo SelO duwe lipatan kinase, nanging ora duwe sawetara residu situs aktif sing disimpen ing kinase klasik (22, 32).Adhedhasar orientasi mbalikke molekul ATP sing kaiket ing situs aktif lan stabil kanthi interaksi spesifik, SelO dihipotesisake lan banjur dikonfirmasi kanggo nransfer AMP (tinimbang fosfat) menyang substrat protein (22), dene protein kaya SelO bakteri liyane YdiU wis bubar wis ditampilake catalyze lampiran kovalen saka UMP kanggo Tyr lan ampas kang saka substrat protein beda (33).
Kanggo ngonfirmasi lan nggedhekake prediksi residu situs aktif putative saka domain coronavirus NiRAN, kita nggunakake metode genetika biokimia lan mbalikke kanggo nindakake analisis mutasi ing coronavirus nsp12 (Gambar 3D lan E lan SI lampiran, Gambar S3 lan tabel) S1â S4).Data kasebut nuduhake yen panggantos HCoV-229E K4135, R4178 lan D4280 kanthi Ala ngilangake aktivitas transferase NMP in vitro lan replikasi virus ing kultur sel (Gambar 3D lan lampiran E lan SI, Gambar S3), ndhukung ngarsane ing NTP γ-fosfat. (K4135, R4178) lan koordinasi ion logam situs aktif (D4280).Substitusi E4145A saka Glu sing dikonservasi ing kisaran virus sarang manuk sing diprediksi bakal nyetabilake posisi K4135 (17) dituduhake kanggo ngilangi replikasi virus, nanging kaget, kegiatan kasebut ditahan ing tes NMPylation in vitro (Gambar 3D lan E lan SI lampiran, Gambar S3 Lan Tabel S1–S4).Pengamatan sing padha ditindakake nalika substitusi sing cocog dienalake ing homolog YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Digabungake, data kasebut ndhukung fungsi pangaturan residu sing dikonservasi tinimbang fungsi katalitik.
Ngganti residu Phe (F4281A) sing dikonservasi ing jangkoan nestovirus ing domain HCoV-229E NiRAN (8) nyebabake nyuda aktivitas NMPylation in vitro lan nyuda signifikan ing replikasi virus ing kultur sel (Gambar 3D, E lan SI) lampiran, Gambar S3).Data kasebut konsisten karo fungsi regulasi penting saka residu iki, kayata residu Phe motif DFG homolog sing ditampilake sadurunge.Ing kinase protein klasik, iku bagéan saka daur ulang Mg2 + lan mbantu kanggo ngumpul lan ngatur utomo???Dibutuhake kanggo aktivitas katalitik sing efektif (32, 34).Ngganti Ala lan Arg kanggo residu K4116 (ing motif preAN), mungguh, ngilangi replikasi virus lan, kaya sing dikarepake, duweni efek sing beda ing aktivitas transferase NMP ing vitro, gumantung saka rantai samping asam amino sing dikenalake (Gambar 3D lan E lan lampiran SI. , Gambar S3).Data fungsional konsisten karo informasi struktural, nuduhake yen residu iki wis nggawe interaksi karo ATP fosfat (17).Ing domain NiRAN saka kulawarga virus bersarang liyane, posisi HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 dikuwasani dening Lys, Arg utawa His (8), nuduhake yen watesan fungsional saka residu spesifik iki wis santai.Substitusi D4188A lan D4283A ngilangi utawa nyuda banget aktivitas enzim lan ngilangi replikasi virus (Gambar 3).Loro residu iki disimpen ing paling (nanging ora kabeh) virus bersarang (8), nuduhake fungsi khusus kulawarga sing penting nanging bisa uga ora katalitik.Substitusi Ala saka sawetara Lys liyane lan ampas Asp (K4113A, D4180A, D4197A lan D4273A) sing ora lestari ing Coronaviridae utawa kulawarga Nestioviridae liyane (8) digunakake minangka kontrol.Kaya sing dikarepake, substitusi kasebut bisa ditrima, kanthi nyuda aktivitas enzim lan replikasi virus ing sawetara kasus (Gambar 3 lan lampiran SI, Gambar S3).Sakabèhé, data mutagenesis koronavirus konsisten banget karo data genetika mandiri GMP lan mbalikke EAV NiRAN-RdRp (16), ing ngendi EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residu K94 (cocog karo HCoV- 229E K4135) fungsi penting), R124 (cocog karo R4178), D132 (cocog karo D4188), D165 (cocog karo D4280), F166 (cocog karo F4281).Kajaba iku, data mutagenesis HCoV-229E konsisten karo lan ditambahi saka data genetika terbalik SARS-CoV sing wis dilaporake sadurunge (16), padha banget karo sing diamati kanggo motif CN sing cocog Phe-to-Ala mutan SARS-CoV_nsp12 The phenotype diterangake -F219A lan HCoV-229E_F4281A (Gambar 3 D lan E lan SI lampiran, Gambar S3 lan Tabel S1-S4).
Dibandhingake karo ortolog EAV (16), sing duwe preferensi sing jelas kanggo UTP lan GTP (ing reaksi NMPylation dhewe), panliten kita nuduhake yen domain coronavirus NiRAN (diwakili dening HCoV-229E lan SARS-CoV-2) bisa efektif. ditransfer Kabeh papat NMP, sanajan ana preferensi tipis kanggo UMP (tokoh 1 lan 3).Spesifisitas relatif rendah saka co-substrat NTP spesifik konsisten karo struktur superkomposit SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 sing bubar dilaporake, ing ngendi ADP-Mg2+ ngiket menyang situs aktif NiRAN, nanging ora karo adenine Part. saka tatanan interaksi tartamtu (17).Ing panliten kita, jinis nukleotida sing digunakake ing reaksi NMPylation ora nduweni efek diferensial ing aktivitas protein mutan (SI Appendix, Gambar S3), nuduhake yen ora ana residu kasebut sing ana hubungane karo ikatan nukleobase tartamtu.Basis struktural lan pinunjul biologis potensial saka macem-macem preferensi co-substrat NTP sing diamati ing domain NiRAN saka coronavirus lan virus arteri isih kudu diteliti;bisa uga bener utawa bisa uga amarga keterbatasan pasinaon.Saiki, ora bisa dikalahake yen aktivitas NMPylator potensial saka domain NiRAN virus arteri (dibandhingake karo aktivitas NMPylation dhewe sing wis ditondoi sadurunge) nduweni preferensi co-substrat sing beda, kanthi nyathet yen kamiripan antarane arteri lan coronavirus. Domain NiRAN ana ing watesan.Bandhingake adhedhasar urutan (16).Dibandhingake karo pseudokinase SelO, sing nggunakake Mg2+ minangka kofaktor, aktivitas koronavirus lan virus arteri NiRAN gumantung ing Mn2+ (16) (Gambar 3C lan SI lampiran, Gambar S1).Katergantungan Mn2 + lan preferensi sing jelas kanggo UTP minangka fitur sing ora biasa saka NMPylators protein, lan mung bubar dikonfirmasi ing protein YdiU saka Salmonella typhimurium, sing nyebabake UMPylation protein chaperone gumantung Mn2 + sing ketat kanggo nglindhungi sel saka induksi stres Kolam ATP sel ( 33).
Persamaan struktural sing bubar diterangake ing antarane domain NiRAN coronavirus lan kinase protein seluler (17, 19) nyedhiyakake dhukungan tambahan kanggo kemampuan NiRAN kanggo nyambungake kovalen NMP menyang protein liyane sing wis dilaporake ing panliten iki.Kita fokus nggoleki target NiRAN sing bisa ditindakake ing protein sing dikode dening HCoV-229E ORF1a, sing dikenal kanthi langsung utawa ora langsung mbantu replika RTC ORF1b-encoded (12, 35).Eksperimen kita nyedhiyakake bukti konklusif kanggo NMPylation efektif lan spesifik saka nsp9 (Gambar 2).Yen protein target digunakake ing keluwihan molar sing 8 nganti 10 kaping luwih dhuwur tinimbang enzim (nsp12), dikonfirmasi nsp9 wis rampung (mono)NMPized (Gambar 4).Kita nyimpulake yen interaksi antarane nsp12 lan nsp9 ora suwe lan ora bakal mbentuk kompleks sing stabil karo nsp9 (tanpa subunit RTC liyane).Kesimpulan iki didhukung dening studi interaksi protein ing proteome SARS-CoV (35).Analisis MS nemtokake amina utama residu N-terminal saka nsp9 minangka situs NMPylation (SI lampiran, Gambar S5).Pembentukan ikatan fosforamidat lan gugus amino N-terminal mbedakake aktivitas NMPylation sing dimediasi NiRAN saka reaksi AMPilasi Pseudomonas syringae SelO-mediated, sing dadi katalis pembentukan AMP sing disambungake O ing Ser, Thr, utawa residu Tyr Peptida adduct ( 22), lan S. typhimurium YdiU mbentuk O-linked (karo Tyr) lan N-linked (karo Kang) peptida-UMP adds.Informasi winates sing kasedhiya ing kulawarga SelO protein nuduhake yen anggota kulawarga protein gedhe iki beda banget ing pambentukan tambahan peptida-NMP.Iki minangka pengamatan sing menarik sing pantes diteliti luwih lanjut.
Data sing dipikolehi ing panliten iki nyebabake hipotesis yen NMPylation saka nsp9 mbutuhake N-terminus gratis.Ing konteks replikasi virus, iki bakal diwenehake dening pembelahan proteolitik saka situs pangolahan nsp8|nsp9 ing poliprotein pp1a replika sing dimediasi dening Mpro lan pp1ab.Ing umume koronavirus, bedane situs tartamtu iki (VKLQ|NNEI ing HCoV-229E) lan kabeh situs pembelahan Mpro coronavirus liyane yaiku Asn (tinimbang residu cilik liyane, kayata Ala, Ser Utawa Gly) manggoni P1â???Panggonan (36).Data cleavage peptida sing dipikolehi ing pasinaon awal nuduhake yen efisiensi belahan situs nsp8|nsp9 luwih murah tinimbang situs liyane, nuduhake yen 1) situs tartamtu iki bisa uga duwe peran pangaturan ing pangolahan koordinasi terminal C sing pas wektune. wilayah pp1a, utawa 2) a Peran saka nsp9 N-terminus konservasi khusus ing replikasi virus (37).Data kita (Gambar 5A) nuduhake yen wangun rekombinan saka nsp9 mawa urutan N-terminal nyata efektif NMPized dening nsp12.Urutan flanking N-terminal dibusak dening faktor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Tabel S1) utawa Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A lan SI lampiran, Tabel S1).Sing penting, prekursor nsp9-nsp9 sing ora dipotong nsp7-11-His6 nuduhake resistensi kanggo NMPylation saka nsp12, sing konsisten karo data kita, nuduhake yen adduct nsp9-NMP dibentuk liwat amina primer N-terminal (SI lampiran, Gambar S5) .Kanggo entuk pangerten sing luwih jero babagan kekhususan substrat NiRAN, kita banjur fokus ing residu N-terminal sing cedhak karo nsp9.Yen ora ana protein liyane, struktur kasebut fleksibel, nyegah supaya ora dideteksi ing wangun nsp9 (26 28, 38), sing nuduhake variasi alami sing winates. fungsi fragmen nsp9 N-terminal.Substitusi saka residu sing dikonservasi ing wilayah iki (Gambar 5C lan D lan lampiran SI, Gambar S8) nuduhake yen N3826 penting kanggo nsp9 NMPylation in vitro, dene substitusi N3825A lan E3827A nyebabake nyuda ing substitusi M3829A lan P3830A. .Temenan mengaruhi nsp9 NMPylation.Sanajan substitusi N-terminal Asn (N3825A, N3825S) mung nduweni efek moderat ing nsp9 NMPylation lan replikasi virus ing kultur sel (Gambar 5C lan D), pambusakan urutan residu Asn saka N-terminal 3825-NN dipeptide mbuktekaken dadi Iku bisa nyebabake virus, nuduhake yen siji ampas Asn dibutuhake sadurunge ampas liyane ing N-terminus, luwih Asn, sanajan misale jek sing substitusi saka ampas padha bisa ditrima sebagian (Figure 5B, C, lan D).Kita nyimpulake manawa dipeptida 3825-NN, utamane residu N3826 sing dikonservasi lan penting ing kisaran koronavirus (lampiran SI, Gambar S6), njamin ikatan lan orientasi sing bener saka nsp9 N-terminus ing situs aktif NiRAN.
Ngganti Ala (E3827A) kanggo Glu sing dikonservasi kabeh subfamili nahan nsp9 NMPylation in vitro nanging bisa nyebabake virus ing kultur sel (Gambar 5C lan D), nuduhake fungsi tambahan saka residu iki, contone, ing interaksi kunci (NMPylated utawa unmodified). ) nsp9 N-terminus lan faktor liyane sing melu replikasi virus.Mutasi Nsp9 ora mengaruhi proses proteolitik saka nsp9 utawa nsps jejer (39) (Lampiran SI, Gambar S9), nuduhake yen fenotipe sing nyebabake sawetara mutasi nsp9 sing diamati ora disebabake dening disregulasi area pp1a terminal proses proteolitik C. .
Data ing ndhuwur menehi bukti yen sawise perawatan sing dimediasi Mpro saka situs cleavage nsp8|9 ing pp1a/pp1ab, N-terminus nsp9 bisa UMPylated (utawa sebagian diowahi karo NMP liyane).Kajaba iku, konservasi N-terminus nsp9 sing apik banget (kalebu residu Asn singular lan invarian ing kulawarga koronavirus) lan data genetika mbalikke sing dipikolehi ing panliten iki (Gambar 3E lan 5D) nyebabake kita nyimpulake yen nsp9 NMPylation diterangake. ana hubungane sacara biologis lan penting kanggo replikasi koronavirus.Konsekuensi fungsional saka modifikasi iki isih kudu ditliti, contone, babagan aktivitas ikatan RNA (non-spesifik) sing wis diterangake sadurunge (non-spesifik) nsp9 (wangun ora dimodifikasi) (2628).N-terminal NMPylation uga bisa mengaruhi interaksi nsp9 karo protein utawa substrat RNA utawa pambentukan rakitan papat tingkat sing beda.Iki wis diamati ing studi struktural lan wis dikonfirmasi minangka fungsional related kanggo replikasi coronavirus, sanajan utamané ing anané Ing kasus modifikasi iki (26- ââ29, 40).
Sanajan spesifik target domain NiRAN koronavirus isih kudu diciriake kanthi luwih rinci, data kita nuduhake manawa spesifik target protein domain NiRAN koronavirus sempit banget.Sanajan konservasi residu situs aktif utama (8, 16) ing domain NiRAN kabeh kulawarga nidovirus ndhukung banget aktivitas NMPylator sing dikonservasi protein kasebut, identitas residu saku pengikat substrat saka domain iki Konservasi lan konservasi tetep dadi ciri. , lan bisa uga beda-beda ing antarane macem-macem kulawarga tujuan Nidovirales.Kajaba iku, target sing cocog kanggo virus bersarang liyane durung ditemtokake.Bisa uga ortolog remot saka nsp9 utawa protein liyane, amarga urutan ing njaba limang domain replika sing umume dikonservasi ing virus bersarang kurang dikonservasi (8), kalebu susunan genom antarane Mpro lan NiRAN, Antarane, nsp9 dumunung ing virus corona.
Kajaba iku, saiki kita ora bisa ngilangi kemungkinan domain NiRAN duwe target tambahan (kalebu seluler).Ing kasus iki, perlu dicathet yen homolog bakteri ing NMPylators protein sing muncul iki (NMPylators) (30, 31) katon duwe "regulator master"?NMP modulates macem-macem protèin seluler kanggo ngatur utawa ngilangi aktivitas hilir, saéngga muter peran ing macem-macem proses biologi, kayata respon kaku seluler lan homeostasis redoks (22, 33).
Ing panliten iki (Gambar 2 lan 4 lan Lampiran SI, Gambar S3 lan S5), kita bisa mbuktekake manawa nsp12 mindhah bagean UMP (NMP) menyang posisi siji (konservasi) ing nsp9, dene protein liyane ora dimodifikasi ing digunakake Ing kahanan, uga-ditetepake (tinimbang ngeculke) specificity substrat didhukung.Konsisten karo iki, dibandhingake karo N-terminal nsp9 NMPylation, aktivitas NMPylation nsp12 dhewe sithik banget, deteksi kasebut mbutuhake wektu paparan autoradiografi sing luwih suwe, lan paningkatan konsentrasi nsp12 kaping 10 digunakake.Kajaba iku, analisis MS kita gagal menehi bukti kanggo NMPylation saka nsp12, sing nuduhake yen NiRAN domain self-NMPylation (paling apik) minangka kegiatan sekunder.Nanging, kudu dicathet yen studi liyane wis nyedhiyakake bukti awal yen status self-AMPylation saka NMPylator bakteri bisa ngontrol aktivitas NMPylation ing substrat protein liyane (22, 33).Mula, riset luwih akeh dibutuhake kanggo nyelidiki efek fungsional saka aktivitas NMPylation diri sing dilaporake kanggo EAV nsp9 (16) lan coronavirus nsp12 (panliten iki), kalebu efek kaya chaperone sing diusulake ing lempitan domain RdRp terminal C ( 16)).
Sadurunge, sawetara hipotesis babagan kemungkinan fungsi hilir domain NiRAN nidoviral wis dianggep, kalebu ligase RNA, transferase guanylate sing ditutupi RNA lan aktivitas priming protein (16), nanging ora ana sing kompatibel karo fungsi hilir sing kasedhiya.Informasi sing dipikolehi ing posisi ing ngisor iki persis ing wektu sing padha tanpa nggawe asumsi tambahan.Data sing dipikolehi ing panliten iki paling konsisten karo (nanging ora bisa mbuktekake) yen domain NiRAN melu ing wiwitan sintesis RNA sing diakibatake protein.Sadurungé dipercaya fungsi domain NiRAN ing 5 ??²-RNA capping utawa reaksi ligasi RNA ora kena pengaruh iki lan Dhukungan data liyane.Mula, contone, situs aktif NiRAN dianggep kalebu Asp sing dikonservasi minangka basis umum (D252 ing Pseudomonas syringae SelO; D4271 ing HCoV-229E pp1ab; D208 ing SARS-CoV-2 nsp12) (Lampiran SI, gambar 2). ).S2) (17, 22, 33), nalika katalisis ing ligase RNA gumantung ATP lan enzim capping RNA ditindakake dening enzim kovalen-(lysyl-N) -NMP intermediate, sing kalebu residu Lys sing ora diganti ( 41).Kajaba iku, kekhususan adhedhasar urutan sing luar biasa saka coronavirus NiRAN kanggo target protein sing dikonservasi lan spesifisitas santai kanggo substrat NTP (luwih seneng UTP) nentang enzim capping sing dimediasi NiRAN utawa fungsi kaya ligase RNA.
Temenan, akeh karya ekstra sing dibutuhake kanggo verifikasi lan, yen kabukten, njlentrehake babagan kemungkinan peran nsp9-UMP (nsp9-NMP) ing sintesis RNA sing diakibatake protein, sing bakal nyambungake sawetara laporan sing menarik nanging (nganti saiki) sing dilaporake sadurunge. .Pengamatan sing diisolasi.Contone, wis ditemtokake manawa pungkasan RNA untaian negatif koronavirus diwiwiti kanthi untaian oligo(U) (42, 43).Pengamatan iki konsisten karo gagasan yen sintesis RNA untai negatif diwiwiti kanthi ngiket wangun UMPylated nsp9 menyang buntut poli(A) ( pemicu), sing bisa dipromosekake kanthi ikatan RNA Aktivitas lan / utawa interaksi karo protein RTC liyane.Bagian UMP sing diwenehake dening nsp9 banjur bisa digunakake minangka "primer" kanggo nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, nggunakake buntut 3??²-poly(A) ing RNA genom utawa Oligo liyane (A) -urutan sing ngemot. serves minangka cithakan, padha karo mekanisme ditetepake kanggo picornavirus VPg protein (44).Kepiye yen proposal kasebut "non-normatif"????Inisiasi sintesis RNA untai negatif (disebabake protein) menehi tautan menyang pengamatan, nuduhake yen RNA untai negatif koronavirus duwe UMP (tinimbang UTP) ing pungkasane (42), sing dianggep nuduhake manawa asam nukleat Dicer mecah mburi fosforilasi dening endonuklease spesifik uridine sing ora dingerteni.Yen dikonfirmasi, aktivitas hidrolitik asam nukleat iki bisa mbantu ngeculake wangun UMPylated oligomerik saka nsp9 saka ujung 5 ² saka untaian negatif sing anyar.Peranan nsp9 ing priming protein uga konsisten karo studi genetika mbalikke sadurunge, sing nuduhake nsp9 (lan nsp8) interaksi kritis lan khusus karo unsur RNA cis-acting sing dikonservasi ing cedhak 3 mburi genom koronavirus.45).Miturut laporan iki, pengamatan sadurunge iki saiki bisa ditliti maneh lan ditambahi liwat riset luwih lanjut.
Ringkesan, data kita nemtokake aktivitas spesifik saka tag enzim virus bersarang proprietary sing disambung karo RdRp ing N-terminus.Ing coronavirus, aktivitas UMPylator/NMPylator sing dimediasi NiRAN sing mentas ditemokake iki digunakake kanggo ngandelake Mn2+ lan residu Asn sing cedhak lan nyebabake pembentukan ikatan fosforamidat (energi rendah) karo amina primer terminal-N.Liwat pembelahan sing dimediasi Mpro ing situs pembelahan nsp8|9, target nsp9 bisa digunakake kanggo NMPylation, nuduhake kopling fungsional antarane protease lan domain NiRAN, sing ngluwihi RdRp.Konservasi residu kunci ing situs aktif nsp12 NiRAN lan target nsp9, digabungake karo data sing dipikolehi saka rong coronavirus kalebu SARS-CoV-2, menehi bukti kuat yen nsp9 NMPylation minangka coronavirus Fitur konservatif uga minangka langkah kunci ing replikasi virus.Data sing kasedhiya ndadékaké kita nyimpulake manawa peran spesifik nsp9 sing diklumpukake ing sintesis RNA sing diakibatake protein minangka skenario sing cukup kanggo coronavirus lan virus bersarang liyane, lan NiRAN bisa uga target protein liyane sing ora dingerteni.Atur virus.Interaksi host.Yen dikonfirmasi, keterlibatan primer protein ing sintesis RNA virus bakal nambah afinitas urutan domain Mpro/3CLpro lan RdRp antarane coronavirus sing dideteksi sadurunge lan supergrup kaya picornavirus (9), sing saiki wis digabungake ing Pisonivirites sing bubar diadegake (9). 46) ing kategori.
Data kita uga nuduhake yen aktivitas enzim dhasar, selektif lan konservatif sing diidentifikasi ing panliten iki bisa digunakake minangka target kanggo obat antivirus.Senyawa sing ngganggu ikatan (lan modifikasi sakteruse) saka nsp9 N-terminus sing dikonservasi ing situs aktif NiRAN bisa dikembangake dadi obat antivirus sing efektif lan serbaguna, cocok kanggo perawatan koronavirus kewan lan manungsa saka macem-macem Infeksi (sub)genus. , kalebu SARS-CoV-2 lan Coronavirus Sindrom Pernafasan Timur Tengah.
Urutan pengkodean protein koronavirus sing diprodhuksi ing panliten iki digedhekake dening RT-PCR nggunakake RNA sing diisolasi saka Huh-7 sing kena infeksi HCoV-229E utawa Vero E6 sing kena infeksi SARS-CoV-2, lan dilebokake nggunakake prosedur kloning standar.pMAL-c2 (Laboratorium Biologi New England) utawa pASK3-Ub-CHis6 (47) vektor ekspresi (SI Lampiran, Tabel S1 lan S2).Substitusi kodon tunggal dikenalake dening mutagenesis sing diarahake situs adhedhasar PCR (48).Kanggo ngasilake protein fusi MBP, sel E. coli TB1 diowahi kanthi konstruksi plasmid pMAL-c2 sing cocog (lampiran SI, Tabel S1).Protein fusi diresiki kanthi kromatografi afinitas amilosa lan dibelah kanthi faktor Xa.Salajengipun, protein C-terminal His6-tagged diresiki dening kromatografi afinitas logam Ni-immobilized (Ni-IMAC) kaya sing wis diterangake sadurunge (49).Kanggo ngasilake protein fusi ubiquitin, sel E. coli TB1 nggunakake konstruksi plasmid pASK3-Ub-CHis6 sing cocog (SI Lampiran, Tabel S1 lan S2) lan pCGI plasmid DNA enkoding ubiquitin-spesifik C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transformasi (47).Protein koronavirus sing diwenehi tag C-terminal His6 diresiki kaya sing diterangake sadurunge (50).
Tes self-NMPylation saka HCoV-229E nsp12-His6 ditindakake kaya sing diterangake ing EAV nsp9 (16).Singkatnya, nsp12-His6 (0,5 µM) ngandhut 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer NTP lan 0,17 µM sing ditemtokake cocog karo [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ing 30 °C suwene 30 menit.Ing kabeh tes NMPilasi (standar) saka nsp12-mediated nsp9 NMPylation, kahanan reaksi diatur kaya ing ngisor iki: nsp12-His6 (0,05 µM) lan nsp9-His6 (4 µM) ing ngarsane 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM dituduhake NTP, lan 0,17 µM cocog [α32-P]NTP.Sawise inkubasi 10 menit ing 30 ° C, sampel reaksi dicampur karo buffer sampel SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminomethane HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% gliserol lan 0,005% bromophenol biru.Protein kasebut didenaturasi kanthi pemanasan ing 90 ° C suwene 5 menit lan dipisahake kanthi 12% SDS-PAGE.Gel kasebut tetep lan diwarnai karo solusi Coomassie Brilliant Blue (metanol 40%, 10% asam asetat, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, lan katon ing layar pencitraan phosphorescent sajrone 20 jam (kanggo ndeteksi nsp12 saka NMPylation) utawa (maksimum) 2 Jam (kanggo netepake nsp9 NMPylation).Imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) digunakake kanggo mindhai layar lan ImageJ digunakake kanggo nganalisa intensitas sinyal.
Kanggo analisis MS, 1 µM nsp12-His6 lan 10 µM nsp9 (tanpa tag hexahistidine) digunakake ing analisis NMPylation (SI lampiran, Tabel S1) lan konsentrasi tambah 500 µM UTP lan GTP digunakake.Gumantung saka konsentrasi lan kualitas protein sing dikarepake, sistem HPLC Kelas H Waters ACQUITY sing dilengkapi kolom MassPrep (Waters) digunakake kanggo ngilangi 1 nganti 10 µL larutan protein buffered kanthi online.Protein desalted dielusi menyang sumber ion electrospray saka Synapt G2Si spektrometer massa (Waters) liwat gradien ngisor buffer A (banyu/0,05% asam format) lan buffer B (acetonitrile/0,045% asam format), lan suhu kolom punika 60 ° C lan laju aliran 0,1 mL / min: elusi isocratically karo 5% A kanggo 2 menit, banjur gradien linear kanggo 95% B ing 8 menit, lan njaga 95% B kanggo liyane 4 menit.
Ion positif kanthi kisaran massa 500 nganti 5000 m/z dideteksi.Glu-fibrinopeptide B diukur saben 45 detik kanggo koreksi drift massa otomatis.Gunakake piranti lunak instrumen MassLynx kanthi ekstensi MaxEnt1 kanggo ngilangi spektrum rata-rata sawise nyuda garis dasar lan smoothing.
UMPylated HCoV-229E nsp9 dicerna kanthi nambahake trypsin (Serva) modifikasi kelas urutan lan diinkubasi sewengi ing 37 °C.Kolom puteran Chromabond C18WP (nomer bagean 730522; Macherey-Nagel) digunakake kanggo ngresiki lan konsentrasi peptida.Pungkasan, peptida dibubarake ing 25 µL banyu, sing ngemot 5% asetonitril lan 0,1% asam format.
Sampel dianalisis nganggo MS nggunakake spektrometer massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Sistem HPLC nanoâ pokok (Dionex), dilengkapi karo end-dipasang khusus 50 cm ??75 μm C18 RP kolom dikempalken karo 2,4 μm manik-manik Magnetik (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Nyambung menyang spektrometer massa online liwat sumber nanospray Proxeon;nyuntikake 6 µL larutan pencernaan tripsin menyang diameter jero 300 µm ×??1 cm C18 Kolom prakonsentrasi PepMap (Thermo Scientific).Nggunakake banyu / 0,05% asam format minangka pelarut, sampel kasebut kanthi otomatis kepepet lan desalinasi kanthi laju aliran 6 µL / min.
Gradien banyu ing ngisor iki / 0,05% asam format (pelarut A) lan 80% asetonitril / 0,045% asam format (pelarut B) digunakake kanggo entuk pamisahan peptida tryptic kanthi laju aliran 300 nL / min: 4% B kanggo 5 menit, banjur 30 A gradien linear kanggo 45% B ing menit, lan nambah linear kanggo 95% solvent B ing 5 menit.Sambungake kolom kromatografi menyang nano-emitor stainless steel (Proxeon), lan semprotan eluen langsung menyang kapiler digawe panas saka spektrometer massa nggunakake potensial 2.300 V. Pemindaian survey kanthi resolusi 60.000 ing Orbitrap mass analyzer digandhengake. kanthi paling ora telung data MS / MS mindai, mbosenke tilar kanggo 30 detik, nggunakake linear ion trap tabrakan mlebu disosiasi utawa luwih energi tabrakan disosiasi digabungake karo deteksi orbitrap , Résolusi punika 7.500.
Wektu kirim: Aug-03-2021